O IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosido) é un análogo do substrato da β-galactosidase, que é altamente inducible. Baixo a indución de IPTG, o indutor pode formar un complexo coa proteína represora, de xeito que a conformación da proteína represora se modifica, de xeito que non se pode combinar co xene diana e este se expresa de forma eficiente. Entón, como se debe determinar a concentración de IPTG durante o experimento? Canto maior, mellor?
Primeiro, comprendamos o principio da indución de IPTG: o operón (elemento) da lactosa de *E. coli* contén tres xenes estruturais, Z, Y e A, que codifican a β-galactosidase, a permease e a acetiltransferase, respectivamente. *lacZ* hidroliza a lactosa en glicosa e galactosa, ou en alolactosa; *lacY* permite que a lactosa do ambiente pase a través da membrana celular e entre na célula; *lacA* transfire o grupo acetilo do acetil-CoA ao β-galactósido, o que implica eliminar o efecto tóxico. Ademais, hai unha secuencia operativa O, unha secuencia inicial P e un xene regulador I. O xene I codifica unha proteína represora que pode unirse á posición O da secuencia operadora, de xeito que o operón (meta) sexa reprimido e desactivado. Tamén hai un sitio de unión para a proteína activadora de xenes catabólicos: o sitio de unión CAP augas arriba da secuencia inicial P. A secuencia P, a secuencia O e o sitio de unión CAP xuntos constitúen a rexión reguladora do operón lac. Os xenes codificantes dos tres encimas están regulados pola mesma rexión reguladora para lograr a expresión coordinada dos produtos xénicos.
En ausencia de lactosa, o operón (meta) lac está nun estado de represión. Neste momento, o represor lac expresado pola secuencia I baixo o control da secuencia promotora PI únese á secuencia O, o que impide que a ARN polimerase se una á secuencia P e inhibe o inicio da transcrición; cando hai lactosa presente, pódese inducir o operón (meta) lac. Neste sistema de operón (meta), o verdadeiro indutor non é a lactosa en si. A lactosa entra na célula e é catalizada pola β-galactosidase para converterse en alolactosa. Esta última, como molécula indutora, únese á proteína represora e cambia a conformación da proteína, o que leva á disociación da proteína represora da secuencia O e á transcrición. O isopropiltiogalactósido (IPTG) ten o mesmo efecto que a alolactosa. É un indutor moi potente, que non é metabolizado por bacterias e é moi estable, polo que se usa amplamente nos laboratorios.
Como determinar a concentración óptima de IPTG? Tomemos como exemplo a E. coli.
A cepa xeneticamente modificada de *E. coli* BL21 que contén o pGEX recombinante positivo (CGRP/msCT) inoculouse en medio líquido LB que contiña 50 μg·mL-1 Amp e cultivouse durante a noite a 37 °C. O cultivo anterior inoculouse en 10 frascos de 50 ml de medio líquido LB fresco que contiña 50 μg·mL-1 Amp nunha proporción de 1:100 para o cultivo de expansión e, cando o valor de OD600 foi de 0,6 a 0,8, engadiuse IPTG á concentración final. É 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Tras a indución á mesma temperatura e ao mesmo tempo, tomouse 1 mL da solución bacteriana e as células bacterianas recolléronse por centrifugación e sometéronse a SDS-PAGE para analizar a influencia de diferentes concentracións de IPTG na expresión de proteínas e, a continuación, seleccionar a concentración de IPTG coa maior expresión de proteínas.
Tras os experimentos, comprobarase que a concentración de IPTG non é a máis alta posible. Isto débese a que o IPTG ten certa toxicidade para as bacterias. Superar a concentración tamén matará a célula; e en xeral, agárdase que canta máis proteína soluble se exprese na célula, mellor, pero en moitos casos cando a concentración de IPTG é demasiado alta, fórmase unha gran cantidade de inclusións no corpo, pero a cantidade de proteína soluble diminúe. Polo tanto, a concentración de IPTG máis axeitada non adoita ser canto maior sexa mellor, senón canto menor sexa a concentración.
O propósito da indución e o cultivo de cepas modificadas xeneticamente é aumentar o rendemento da proteína diana e reducir os custos. A expresión do xene diana non só se ve afectada polos factores propios da cepa e o plásmido de expresión, senón tamén por outras condicións externas, como a concentración do indutor, a temperatura de indución e o tempo de indución. Polo tanto, en xeral, antes de expresar e purificar unha proteína descoñecida, é mellor estudar o tempo de indución, a temperatura e a concentración de IPTG para seleccionar as condicións axeitadas e obter os mellores resultados experimentais.
Data de publicación: 31 de decembro de 2021