O ditiotreitol (DTT) é un axente redutor de uso común, tamén coñecido como o novo aditivo verde. É un composto orgánico molecular pequeno con dous grupos mercaptanos (-SH). Debido ás súas propiedades redutoras e estabilidade, o DTT úsase amplamente en experimentos de bioquímica e bioloxía molecular.
A función principal do DTT é reducir as pontes disulfuro nas proteínas e outras biomoléculas. A ponte disulfuro é unha parte importante do pregamento e a estabilidade das proteínas, pero baixo certas condicións experimentais, como a análise SDS-PAGE reducible, a recombinación e o pregamento de proteínas, é necesario reducir a ponte disulfuro a dous grupos tiol para desentrañar a estrutura espacial da proteína. O DTT pode reaccionar coas pontes disulfuro para reducilas a grupos mercaptanos, abrindo así a estrutura espacial da proteína e facilitando a súa análise e manipulación.
O DTT tamén se pode empregar para protexer a actividade e a estabilidade dos encimas. Nalgunhas reaccións catalizadas por encimas, a actividade do encima pode ser reducida polo oxidante. O DTT pode reaccionar cos oxidantes para reducilos a substancias inofensivas, protexendo así a actividade e a estabilidade do encima.
En comparación cos axentes redutores tradicionais como o β-mercaptoetanol (β-ME), o DTT considérase un axente redutor máis seguro e estable. Non só é estable en solución acuosa, senón que tamén mantén as súas propiedades redutoras a altas temperaturas e en condicións ácido-base.
O uso do DTT é relativamente sinxelo. En xeral, o DTT disólvese nun tampón axeitado e despois engádese ao sistema experimental. A concentración óptima de DTT debe determinarse segundo o experimento específico e úsase xeralmente no rango de 0,1-1 mM. Concentracións máis baixas poden reducir os efectos adversos sobre o crecemento celular e a citotoxicidade debido á sobreexpresión das proteínas diana. Concentracións máis altas poden causar unha carga metabólica celular excesiva, o que afecta o crecemento celular e a eficiencia da expresión.
A forma de determinar a concentración óptima pode ser avaliar o nivel de expresión da proteína diana realizando probas de indución de IPTG a diferentes concentracións. As probas de cultivo a pequena escala pódense realizar usando unha gama de concentracións de IPTG (por exemplo, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) e o efecto da expresión a diferentes concentracións pódese avaliar detectando o nivel de expresión da proteína diana (por exemplo, Western blot ou detección de fluorescencia). De acordo cos resultados experimentais, a concentración co mellor efecto de expresión seleccionouse como a concentración óptima.
Ademais, tamén podes consultar a literatura relevante ou a experiencia doutros laboratorios para comprender o rango de concentración de IPTG que se emprega habitualmente en condicións experimentais similares e, a seguir, optimizalo e axustalo segundo as necesidades experimentais.
É importante ter en conta que a concentración óptima pode variar dependendo dos diferentes sistemas de expresión, proteínas diana e condicións experimentais, polo que é mellor optimizala caso por caso.
En resumo, o DTT é un axente redutor de uso común que se pode empregar para reducir as pontes disulfuro en proteínas e outras biomoléculas e para protexer a actividade e a estabilidade dos encimas. Empregouse amplamente en experimentos de bioquímica e bioloxía molecular.
Data de publicación: 28 de setembro de 2023