O IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosido) é un análogo do substrato da β-galactosidasa, que é altamente inducible.Baixo a indución de IPTG, o inductor pode formar un complexo coa proteína represora, de xeito que se cambia a conformación da proteína represora, de modo que non se pode combinar co xene diana e o xene diana exprésase eficientemente.Entón, como debería determinarse a concentración de IPTG durante o experimento?Canto máis grande mellor?
En primeiro lugar, entendamos o principio da indución de IPTG: o operón (elemento) de lactosa de E. coli contén tres xenes estruturais, Z, Y e A, que codifican a β-galactosidasa, a permease e a acetiltransferase, respectivamente.lacZ hidroliza a lactosa en glicosa e galactosa, ou en alo-lactosa;lacY permite que a lactosa do medio pase a través da membrana celular e entre na célula;lacA transfire o grupo acetilo do acetil-CoA ao β-galactósido, o que implica a eliminación do efecto tóxico.Ademais, hai unha secuencia operativa O, unha secuencia inicial P e un xene regulador I. O código do xene I é unha proteína represora que pode unirse á posición O da secuencia do operador, de xeito que o operón (meta) é reprimido e apagado.Tamén hai un sitio de unión para o sitio de unión da proteína activadora do xene catabólico á CAP augas arriba da secuencia iniciadora P. A secuencia P, a secuencia O e o sitio de unión CAP constitúen xuntos a rexión reguladora do operón lac.Os xenes codificantes dos tres encimas están regulados pola mesma rexión reguladora para conseguir a expresión coordinada dos produtos xenéticos.
En ausencia de lactosa, o operón lac (meta) está en estado de represión.Neste momento, o represor lac expresado pola secuencia I baixo o control da secuencia promotora PI únese á secuencia O, o que impide que a ARN polimerase se una á secuencia P e inhibe o inicio da transcrición;cando está presente a lactosa, pódese inducir o operón lac (meta) Neste sistema de operón (meta), o verdadeiro inductor non é a propia lactosa.A lactosa entra na célula e é catalizada pola β-galactosidase para converterse en alolactosa.Esta última, como molécula inductora, únese á proteína represora e cambia a conformación da proteína, o que leva á disociación da proteína represora da secuencia O e da transcrición.O isopropiltiogalactosido (IPTG) ten o mesmo efecto que a alolactosa.É un inductor moi potente, que non é metabolizado polas bacterias e é moi estable, polo que é moi utilizado nos laboratorios.
Como determinar a concentración óptima de IPTG?Tome E. coli como exemplo.
A cepa de E. coli BL21 modificada xeneticamente que contén o pGEX recombinante positivo (CGRP/msCT) foi inoculada en medio líquido LB que contén 50μg·mL-1 Amp e cultivouse durante a noite a 37 °C.O cultivo anterior foi inoculado en 10 botellas de 50 ml de medio líquido LB fresco que contén 50 μg·mL-1 Amp nunha proporción de 1:100 para o cultivo de expansión, e cando o valor OD600 era de 0,6 ~ 0,8, engadíuse IPTG á concentración final.É de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Despois da indución á mesma temperatura e ao mesmo tempo, tomouse dela 1 mL da solución bacteriana, e as células bacterianas foron recollidas por centrifugación e sometidas a SDS-PAGE para analizar a influencia de diferentes concentracións de IPTG na expresión da proteína, e despois seleccionar a concentración de IPTG con maior expresión proteica.
Despois dos experimentos, comprobarase que a concentración de IPTG non é o máis grande posible.Isto débese a que o IPTG ten unha certa toxicidade para as bacterias.Superar a concentración tamén matará a célula;e, en xeral, esperamos que canta máis proteína soluble se exprese na célula, mellor, pero en moitos casos, cando a concentración de IPTG é demasiado alta, formarase unha gran cantidade de inclusión.corpo, pero a cantidade de proteína soluble diminuíu.Polo tanto, a concentración de IPTG máis axeitada adoita non ser canto maior sexa mellor, senón menor concentración.
O propósito da indución e o cultivo de cepas modificadas xeneticamente é aumentar o rendemento da proteína diana e reducir os custos.A expresión do xene diana non só se ve afectada polos propios factores da cepa e o plásmido de expresión, senón tamén por outras condicións externas, como a concentración do inductor, a temperatura de indución e o tempo de indución.Polo tanto, en xeral, antes de que se exprese e purifique unha proteína descoñecida, o mellor é estudar o tempo de indución, a temperatura e a concentración de IPTG para seleccionar as condicións adecuadas e obter os mellores resultados experimentais.
Hora de publicación: 31-12-2021