O ditiotreitol (DTT) é un axente redutor de uso común, tamén coñecido como o novo aditivo verde.É un composto orgánico molecular pequeno con dous grupos mercaptanos (-SH).Debido ás súas propiedades redutores e estabilidade, a DTT úsase amplamente en experimentos de bioquímica e bioloxía molecular.
A función principal da DTT é reducir os enlaces disulfuro nas proteínas e outras biomoléculas.O enlace disulfuro é unha parte importante do pregamento e estabilidade das proteínas, pero en determinadas condicións experimentais, como a análise SDS-PAGE reducible, recombinación e pregamento de proteínas, é necesario reducir o enlace disulfuro a dous grupos tiol para desentrañar a estrutura espacial do a proteína.A DTT pode reaccionar con enlaces disulfuro para reducilos a grupos mercaptanos, abrindo así a estrutura espacial da proteína e facilitando a súa análise e manipulación.
A DTT tamén se pode usar para protexer a actividade e a estabilidade dos encimas.Nalgunhas reaccións catalizadas por encimas, a actividade do encima pode verse reducida polo oxidante.O DTT pode reaccionar cos oxidantes para reducilos a substancias inofensivas, protexendo así a actividade e a estabilidade do encima.
En comparación cos axentes redutores tradicionais como o β-mercaptoetanol (β-ME), a DTT considérase un axente redutor máis seguro e estable.Non só é estable en solución acuosa, senón que tamén mantén as súas propiedades redutores en condicións de alta temperatura e ácido-base.
O uso da TDT é relativamente sinxelo.En xeral, a TDT disólvese nun tampón apropiado e despois engádese ao sistema experimental.A concentración óptima de DTT debe determinarse segundo o experimento específico e úsase xeralmente no intervalo de 0,1-1 mM.As concentracións máis baixas poden reducir os efectos adversos sobre o crecemento celular e poden reducir a citotoxicidade debido á sobreexpresión das proteínas diana.As concentracións máis altas poden causar unha carga metabólica celular excesiva, afectando o crecemento celular e a eficiencia da expresión.
A forma de determinar a concentración óptima pode ser avaliar o nivel de expresión da proteína diana realizando probas de indución de IPTG a diferentes concentracións.As probas de cultivo a pequena escala pódense realizar utilizando un intervalo de concentracións de IPTG (por exemplo, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) e o efecto da expresión a diferentes concentracións pódese avaliar detectando o nivel de expresión da proteína diana (por exemplo, Western detección de mancha o fluorescencia).Segundo os resultados experimentais, seleccionouse a concentración con mellor efecto de expresión como a concentración óptima.
Ademais, tamén pode consultar a literatura relevante ou a experiencia doutros laboratorios para comprender o intervalo de concentración de IPTG de uso común en condicións experimentais similares e, a continuación, optimizar e axustar segundo as necesidades experimentais.
É importante ter en conta que a concentración óptima pode variar dependendo de diferentes sistemas de expresión, proteínas diana e condicións experimentais, polo que é mellor optimizar caso por caso.
En resumo, o DTT é un axente redutor de uso común que se pode usar para reducir os enlaces disulfuro en proteínas e outras biomoléculas e para protexer a actividade e a estabilidade dos encimas.Foi moi utilizado en experimentos de bioquímica e bioloxía molecular.
Hora de publicación: 28-09-2023